作者 | 靓靓

编辑 |  小静子

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荧光定量PCR,相信是各位做分子的同僚们都很熟悉的一个检测手段，通过在反应体系中加入荧光分子，通过荧光信号的按比例增加来反应DNA量的增加，使PCR产物的实时检测成为可能。

由于实时定量建立在模板的初始浓度与CT关系的基础上，因此荧光定量PCR的优化非常重要，保证样本具有准确可重复的实验结果。优化的qPCR结果有以下特点：

1.线性的标准曲线R²>0.980

2.高扩增效率90-105%

3.一致的重复反应 STD<0.5

一种最有效的用来确定qPCR实验是否最优化的方法：将模板稀释成一系列浓度梯度进行PCR反应，用该结果做标准曲线。模板可以用已知浓度的样本（如纳克级的基因组DNA或多拷贝数的单克隆质粒），也可以用未知浓度的样品（如cDNA）。用模板的初始量（或未知浓度样品的稀释倍数）的log值对每个稀释样品的CT值作图，两者呈递减的线性关系，此时就得到了标准曲线。

理论上，一系列稀释样品的扩增曲线之间有均匀的间距，

如下图所示（ABI stepone）：

如果产物在每一循环都加倍，荧光曲线之间的间距由等式“2^n=稀释倍数”决定，这里n是CT值之间的间距。按理想情况来看，10倍稀释的样品，2^n=10，因此，n=3.32；将上图中每个稀释样品的CT值与初始模板量的拷贝数值做标准曲线，

结果如下图：

图中显示了斜率Slope为-3.37，R2值为0.999，扩增效率为98.2%（扩增效率的计算公式为E=(10^(-1/Slope）-1）%。

扩增效率接近100%是优化实验好的最佳标志，实际操作时，扩增效率最好可以在90%-105%之间，如果扩增效率不理想，一般有以下几种原因：

接下来为大家介绍几个优化PCR的方法：

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检查仪器，卤素灯是否老化，PCR仪热槽是否被荧光物质污染；

 

以上几种办法呢，就是小编总结下来，比较常用的优化办法了，其中小编想着重讲一下的，是稀释buffer这个小法宝。

 

遥想几个月之前，小编遇到了qPCR生涯中的一个超级大瓶颈！！

有那么几个样本，它的扩增效率是这样子的：

虽然R²值很好，但是扩增效率都低于90%，蓝瘦！香菇！！

 

于是小编开始了漫漫优化之路，

 

尝试了降低退火温度，不行！

三步法PCR，不行！！

增加延长时间，不行！！！

尝试了优化反应体系，增加引物浓度，不行！！！！

尝试了重新制备模板，还是不行不行不行！！！！！

 

 

最后不得不面对现实，我知道常规手段不足以应对这种情况，看来得换个思路用尽生平所学了！！我随后买来了两个公司的DNA稀释液（A和B），并同时自配稀释液（TK）再实验。

 

果真是苍天不负有心人

转角才能见男神啊~！

 

以下是使用三种稀释液以及NF-H2O对同一模板进行稀释后得到的标曲：

 

NF-H₂O

（标准曲线：y = -3.64㏒x +40.22    R²=1    E=88.3%）

 

 

A公司

（标准曲线：y = -3.53 ㏒x +39.45    R²=0.998   E=92.1%）

 

B公司

 

（标准曲线：y = -3.57 ㏒x +39.17   R²=1   E=90.5%）

 

天科（TK）

(标准曲线：y = -3.48 ㏒x +38.39   R²=0.999   E=94.0%)

这回结果就相当令人满意了~

可以看出用专门的稀释剂对模板进行稀释的效果普遍优于用NF-H2O稀释的结果，但是哪一家是最优结果呢？小编自配的TK可以说是当之无愧啦，E值以及R2值都很优秀，最重要的一点是，小编总共将模板稀释了8个梯度，其他两家公司得到的有效点只有七个，TK得到了八个点的有效数据，从今以后都用这来做各位上帝的样本哟，请各位放心的送样吧！

 

以上就是小编对qPCR实验优化的一点小的心得，希望对各位看官老爷有所帮助；要是您在做PCR时遇到问题，用了以上几点方法，或者尝试了更多其他方法，都不能解决的话，请试试更换引物好吗？请看我这真诚的大眼睛(・(ｪ)・) ，有时候扩增效率低是引物本身不好造成的，与其再花大量的精力与时间在优化上，重新设计引物，可能是更好的选择哟！