PCR检测技术是检测生物体内核酸的方法，现在发展为普通的常规PCR和实时荧光PCR两种应用，它们都具有PCR技术本身的高灵敏度和高特异性的特点，但实时荧光PCR技术额外加入特异的荧光分子探针，进行鉴别，因此结合了分子鉴别方法，具有更高的特异性。另外普通PCR技术的结果检测为肉眼观察的电泳结果，灵敏度远远低于荧光仪器的检测灵敏度。最后，如果加入已知浓度的标准品，还可以得出病源体的定量结果。因此可以说，实时荧光PCR技术集PCR和分子鉴别技术于一身，又具有定量的功能，可以进行病源体和病情监督。
专业的特异性片段筛选。为保证检测的特异性和灵敏性，我们从公共数据库下载待检测微生物的基因序列，通过比对，找到种内保守、种间特异的基因序列。以李斯特菌为例，将其38个基因组的所有蛋白利用Blastp和HOGENOM release 6 database做比对，来自不同菌的直系同源蛋白都会和同一个HOGENOM 蛋白家族比对上。我们将多拷贝的蛋白从候选基因组除去（有时，一个菌会有多个同源蛋白）。之后，我们将深入比较来自38个李斯特菌的直系同源蛋白间的变异程度，平均变异度大于5%的，也过滤掉。剩余的基因可以被认为是在种间高度保守的。进一步验证其种间高度特异。为了进一步验证其在种外的高度特异性，我们将筛选得到的基因序列，在利用Blastn，和NCBI的NR库进行比对，最终确定候选基因。
专业的引物和探针的设计软件。对于候选得到的基因，利用Primer Express®设计扩增引物和Taqman探针。为保证检查的高效性，探针由AB公司合成。
检测平台权威性。我们利用ABI7500为检测平台。
完成整套实验方案的建立。包括引物设计，扩增条件优化，特异性、敏感性实验等。
