1993 年，哈佛大学的罗莎琳德•李 (RosalindLee) 等人在《细胞》杂志上发表论文，称在线虫中发现了控制幼虫发育的“ lin-4 基因”所编码产生的短小 RNA ，这种 RNA 可以与 lin-14 基因产生的 mRNA结合，并抑制它的功能，使它无法被翻译，最终控制 LIN-14 蛋白质的产生。这是人们首次发现微小RNA （ MicroRNA ， miRNA ）对于生物体基因表达的调节作用。到目前人们已对 miRNA 做了大量的研究，先后在病毒、真菌、植物、动物、人体等生物体内发现了大约 28600 多个 miRNA ，并揭示出 miRNA 参与了细胞生长、个体发育、疾病发生、衰老过程等多种生物学过程。

miRNA相关研究论文数逐年呈指数增长，截止到2015年3月

　　miRNA通过对基因表达的调控实现着对上述生物学过程的调控与影响。该机制自发现以来一直对生物医学产生着重要的影响，它为人们认识、干预各种生命现象提供了一个新的视角与途径。特别是在医学领域人们已在各种疾病中进行了大量的研究寻找miRNA发病、治疗与诊断的关系，并获得大量宝贵的数据。miRNA正逐步地以治疗手段、治疗靶点或者诊断标记物等多重角色迈向临床应用。以miR-122为靶点的HCV治疗药物SPC3649已进入临床试验阶段，而作为诊断标记物miRNA更是在各种体液与组织中被大量地研究。

　　面对miRNA的研究时代，面对即将来临的miRNA临床应用时代，你是否有足够的知识储备？以下是浙江天科团队为您解析2014年来发表临床相关的miRNA的文章，包括浙江天科协助客户发表的临床文章，帮您梳理如何通过研究miRNA，发表临床科研成果。

　　Glucocorticoids mediate induction of microRNA-708 to suppress ovarian cancer metastasis through targeting Rap1B, NATURE COMMUNICATIONS, 6:5917, DOI: 10.1038/ncomms6917

第一篇文章发表在NATURE COMMUNICATIONS（IF=10.742）上。这篇文章主要讲的是糖皮质激素，对于miR-708表达的影响。糖皮质激素主要与卵巢癌化疗药物联合使用，它可以防止细胞的超敏反应。该研究发现在糖皮质激素处理后会激活miR-708的表达，从而抑制Rap1B蛋白，制约了黏着斑的形成，从而抑制了卵巢癌的迁移侵袭。通过实验恢复Rap1B的表达，可以重新增强卵巢癌细胞的转移能力。在临床上，低表达水平的miR-708和高表达水平的Rap1B往往是卵巢癌晚期病人的特征。所以，此研究揭示了糖皮质激素和其下游的作用基因（miR-708和Rap1B）在卵巢癌治疗中的作用。

　　下面是关于这篇文章的技术路线图

　　Loss of Estrogen-Regulated microRNA Expression Increases HER2 Signaling and Is Prognostic of Poor Outcome in Luminal Breast Cancer, Cancer Res; 75(2) January 15, 2015

第二篇文章发表在Cancer Research（IF=9.284）上。是在Luminal A型（ER+ ，Her2-）乳腺癌中，雌激素受体调控的MiRNA簇，对于Her2的调控。研究表明雌激素受体蛋白（ER）通过对miRNA作用可以调控乳腺癌的信号传导。本研究利用芯片技术发现了87个miRNA在MCF7和 MCF7:2A两个细胞系里有差异表达，包括let-7c, miR99a, 和miR125b，这些miRNA在MCF7细胞中是ER的靶标。在Luminal肿瘤中，这些miRNA的表达水平在A型中比B型高。有趣的是，这些相对低表达水平的miRNA会导致较差的生存率。研究小组明确了miR125b和let-7c直接靶向HER2蛋白，同时HER2蛋白的表达活性和let-7c负相关。所以，研究证实了ER介导的miRNA簇通过调控HER2蛋白产生作用。

　　下面是关于这篇文章的技术路线图

　　Characterization and comparative profiling of ovarian microRNAs during ovine anestrus and the breeding season, BMC Genomics, 2014, 15:899

　　这篇文章是2014年发在BMC genomics上（影响因子为4.0）。研究者发现绵羊的季节性发情是其繁育速度的限制因素，在不同的季节卵巢生物学和荷尔蒙分泌有不同的特征。前期的研究发现小RNA在卵巢调节中起重要作用，为了进一步研究这些miRNA的作用，研究者利用高通量测序对发情期和非发情期的绵羊进行了研究。通过测序技术，一共鉴定到483个miRNAs，其中有25个miRNA表达成显著差异，KEGG功能分析发现这些差异miRNAs的靶基因主要富集在荷尔蒙分泌的相关路径。同时，这些差异表达的miRNAs和它们的靶基因的表达成负相关。此外，除了miRNAs，一些piRNA也被鉴定到了。这个研究结果帮助我们进一步了解了绵羊在发情期的生理变化。

　　下面是关于这篇文章的技术路线图

　　Expression Profile Analysis of microRNAs in Prostate Cancer by Next-Generation Sequencing, The Prostate 75:500–516 (2015)

　　这篇文章是2015年发在The Prostate上（影响因子为3.0），浙江天科的研究团队为共同作者。这个项目是研究miRNAs与前列腺癌恶性程度的相关性。研究者通过对高恶性程度（G>7）、低恶性程度（G＜7）和前列腺增生样本的组织进行miRNA测序，一共发现了18个差异表达的miRNAs，其中，miR-125b-5p，miR-126-5p，miR-151a-5p, miR-221-3p, and miR-222-3p在肿瘤组织中有显著性的上调，而miR-486-5p显著下调。通过靶基因预测和富集分析，发现这些基因主要富集与信号传导、细胞交流等通路中，特别是肿瘤相关的PI3K-Akt和p53信号途径。这个研究表明，通过对miRNA的表达水平进行研究，可以解释前列腺癌的发生、发展，部分miRNAs也可以作为诊断标志物。

　　设计思路

　　下面是关于这篇文章的技术路线图

　　A Prognostic Model of Triple-Negative Breast Cancer Based on miR-27b-3p and Node Status, PLoS ONE 9(6): e100664.

　　这篇文章是2014年发在PLoS ONE上（影响因子为3.0），浙江天科的研究团队为共同作者。这个项目是研究利用miRNAs来作为三阴性乳腺癌的诊断。 三阴性乳腺癌 （TNBC ）是指雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）和人表皮生长因子受体（HER2）均阴性的一种特殊类型乳腺癌。TNBC约占所有乳腺癌的15%，其许多生物学特性和基底细胞样型乳腺癌相似，但两者之间存在某些基因表达谱和免疫表型上的差异，因此亦不能完全等同。TNBC因缺乏内分泌及抗HER2治疗的靶点，目前尚无针对性的标准治疗方案。研究小组收集了58例（2002年-2012年）TNBC样本，其中31例为转移样本，27为未出现转移样本。根据文献，选择了5个miRNAs（miR-21-5p, miR-27b-3p, miR-103a-3p, miR-107, 和miR-210）作为筛选标记，结果显示，miR-27b-3p、miR-107和miR-103a-3p 在转移样本中有显著性的升高（p＜0.01）。随后，我们又对新收集的41例样本进行此3个miRNAs验证，结果发现miR-27b-3p仍表现出很好的特异性和灵敏性，可以作为一个候选的诊断标志物。

　　下面是关于这篇文章的技术路线图

A． miRNA 的定义

　　miRNA是一组由基因组编码的长度约20～25个核苷酸的非编码RNA，通过和靶基因mRNA碱基配对引导沉默复合体(RISC)降解mRNA或阻碍其翻译。miRNA在物种进化中相当保守，在植物、动物和真菌中发现的miRNA大部分在特定的组织和发育阶段表达。miRNA的组织特异性和时序性，决定组织和细胞的功能特异性，表明miRNA在细胞生长和发育过程的调节过程中起多种作用。

B ．miRNA 的形成与作用机制

　　1、miRNA的基因通常位于基因间、内含子区或者编码基因的互补链上，几个不同的miRNA可以串联形成一个转录子。miRNA基因的转录方向常常与邻近基因或者宿主基因的转录方向相反，具有独立的转录调控。

　　2、其编码基因在RNA聚合酶II的作用下转录形成Pri-miRNA（原始miRNA）。Pri-miRNA与mRNA相类似具有5’端帽子和3’端PolyA尾，但通常会含有1个或多个茎环结构。

　　3、转录形成的Pri-miRNA首先与dsRNA结合蛋白Pasha结合然后在Drosha核酸酶的作用下被加工形成Pre-miRNA(前体miRNA)。Pre-miRNA为长约70个核苷酸的茎环结构，其3’末端含2个核苷酸突出。

　　4、Pre-miRNA在RNA-GTP依赖的核质/胞质转运蛋白Exportin 5的作用下从核内转运到胞质内。Exportin 5、RNA-GTP和Pre-miRNA形成异源聚合物，穿过核孔后RNA-GTP转变为RNA-GDP，同时释放出Pre-miRNA。

　　5、Pre-miRNA在胞浆内在Dicer酶（一种双链RNA内切酶）的作用下剪切成长度约21～25bp的双链miRNA，即miRNA:miRNA*双链，其中miRNA*为miRNA的互补链。该双链很快被解链，其中一条与RNA诱导沉默复合体（RISC）结合形成成熟的miRNA，另外一条则被迅速降解。

　　6、miRNA所形成的RISC复合物通过miRNA与目的mRNA的3’UTR区不完全配对结合时，可使mRNA的翻译过程受阻进而影响目的蛋白表达水平；当miRNA与目的mRNA完全匹配时，可引起mRNA在互补区的特异性断裂，从而形成基因沉默。（miRNA 5’端的2-8个碱基为种子序列区，通常该序列区需与目的基因完全匹配才能对相应基因进行调控）。

　　7、一个miRNA可以同时调控多个基因，而单个基因也可受多个miRNA的调控。

miRNA的形成与作用机制

C ．miRNA 数据库

　　miRBase序列数据库是存储miRNA信息最主要的公共数据库之一，提供公布的miRNA序列及注释信息。目前miRBase(Release 21)记录了28645个miRNA。网址：http://www.mirbase.org/

D ．MicroRNA 的命名规则

　　1、miRNA成熟体命名规则(以动物miRNA为例)

　　　①确定命名规则之前发现的miRNA，则保留原来名字，如hsa-let-7。

　　　②miRNA成熟体简写成miR，再根据其物种名称，及被发现的先后顺序加上阿拉伯数字，如hsa-miR-122；

　　　③高度同源的miRNA在数字后加上英文小写字母(a,b,c,…)，如hsa-miR-34a，hsa-miR-34b，hsa-miR-34c等；

　　　④由不同染色体上的DNA序列转录加工而成的具有相同成熟体序列的miRNA，则在后面加上阿拉伯数字以示区分，如hsa-miR-199a-1和hsa-miR-199a-2；

　　　⑤通常一个miRNA前体长度大约为70~80nt，很可能两个臂分别产生miRNA。以前的做法是：表达水平较高的miRNA后面不加任何符号，而表达水平较低的miRNA后面加上*号，如rno-miR-9*。有时带“*”的miRNA就根本不出现。而如果没有明显的表达差异，则以“-5p”和“-3p”分别命名。如hsa-miR-26b-5p和hsa-miR-26b-3p，分别表明从hsa-mir-26b前体的5’端臂和3’端臂加工而来的。

　　在以前的命名中，有时也会以“-s”和“-as”来命名，但现在已经取消了这种命名方式。

　　注意：miRBase18.0对miRNA成熟体的名称进行了大量的修改，很多带“*”的miRNA都变成了“-5p”或“-3p”。当然，新名称下面对应有其原来的名称。

　　2、miRNA编号及名称(以动物miRNA为例)

　　　①发夹状结构的miRNA前体转录本以“mir”命名，其编号以“MI”编号，如人的miRNA 122的前体ID为hsa-mir-122，Accession为MI0000442。

　　　②大约20～23nt的miRNA成熟体以“miR”命名，其编号以“MIMAT”编号，如人的miR-122有两个成熟体，其中之一ID为hsa-miR-122-5p ，Accession为 MIMAT0000421;另一个为ID为hsa-miR-122-3p，Accession为 MIMAT000 4590。

　　3、不同物种命名方式差别

　　　①动物：

　　　miRNA前体：以动物物种缩写+“-”+ mir+“-”+命名顺序，如hsa-mir-122；

　　　miRNA成熟链：以动物物种缩写+“-”+ miR+“-”+命名顺序，如hsa-miR-122-5p；②植物：

　　　miRNA前体：以植物物种缩写+“-”+ MIR+命名顺序，如ath-MIR156a。注意：MIR是大写，并与命名顺序之间没有“-”；

　　　miRNA成熟链：以植物物种缩写+“-”+ miR+命名顺序，如ath-miR156a。注意：miR是小写，并与命名顺序之间没有“-”；

　　　③ 病毒：

　　　miRNA前体：以病毒物种缩写+“-”+ mir+命名顺序，如bhv1-mir-B1；

　　　miRNA成熟链：以病毒物种缩写+“-”+ miR+命名顺序，如bhv1-miR-B1。